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組織切片免疫染色技術(shù)的操作方法分析

閱讀次數(shù)：1346 發(fā)布時(shí)間：2013/8/6 9:37:34

組織切片免疫染色技術(shù)的操作方法分析

一、組織切片免疫染色過(guò)程

組織切片免疫染色技術(shù)可分為3個(gè)步驟：①組織的制備和切片；②樣本與抗體結(jié)合；③檢測(cè)。

樣本被固定到載玻片上后，加特異性抗體與其相應(yīng)的抗原結(jié)合，沒(méi)有結(jié)合的抗體則被洗掉；再加標(biāo)記的相應(yīng)二抗，與一抗發(fā)生特異性反應(yīng)；沖洗后，抗原的位置可以通過(guò)檢測(cè)標(biāo)記的二抗而得知。

二、組織標(biāo)本的制備

免疫染色的組織材料主要有兩種來(lái)源。首先，研究者可以自己收集、固定標(biāo)本，這樣所有的步驟都可以優(yōu)化。盡管如此，但大多研究者還是希望實(shí)驗(yàn)的組織材料是在病理室貯存的或在其他貯藏器內(nèi)貯存的材料。這些標(biāo)本常以石蠟包埋塊貯存，來(lái)源于組織化學(xué)分析以及抗原分析的有關(guān)信息極為重要。但是應(yīng)該認(rèn)識(shí)到這些樣品的收集存在以下的問(wèn)題：①固定的時(shí)間和條件很難標(biāo)準(zhǔn)化；②固定液、貯存條件及貯存時(shí)間不同。在這種情況下，有些抗原、抗體結(jié)合的結(jié)果意義不大，因其對(duì)不同的固定不很敏感，對(duì)另外一些檢測(cè)也許很有意義。

目前貯存收集的樣本常常是速凍組織，這是免疫染色有價(jià)值材料的來(lái)源。但是也很難標(biāo)準(zhǔn)化，且組織化學(xué)信息資源有限。冷凍切片所得的標(biāo)本可與多數(shù)來(lái)源的抗體較好地發(fā)生反應(yīng)。以下分別介紹制備組織標(biāo)本的主要方法。這里不涉及如何使用不同型號(hào)的切片機(jī)和恒冷箱切片機(jī)進(jìn)行組織切片，因其操作方法差異很大。

三、結(jié)合

一旦組織被固定并有良好的透過(guò)性，就可以加入抗體。與其他許多免疫化學(xué)技術(shù)一樣，可以直接標(biāo)記一抗，或者通過(guò)使用標(biāo)記的二抗，再與一抗特異結(jié)合進(jìn)行檢測(cè)。一般情況，直接標(biāo)記的一抗可以形成較低背景的清晰信號(hào)，直接檢測(cè)的主要缺點(diǎn)是一抗的標(biāo)記和純化的準(zhǔn)備費(fèi)時(shí)，這使得直接檢測(cè)用于組織免疫染色更加困難。除特殊情況外，推薦采用商業(yè)來(lái)源的各種標(biāo)記的二級(jí)試劑進(jìn)行間接檢測(cè)。

間接檢測(cè)時(shí)一些試劑可以與一抗特異性結(jié)合，發(fā)揮橋連作用，這些試劑包括抗免疫球蛋白抗體，蛋白A或蛋白G，或者一抗用生物素、鏈霉親和素標(biāo)記。間接標(biāo)記的主要優(yōu)點(diǎn)是一種標(biāo)記試劑可以用于多種一抗的檢測(cè)。間接檢測(cè)方法一般可得到較強(qiáng)的信號(hào)，但背景較高。因此，必須設(shè)置適當(dāng)?shù)膶?duì)照。

組織免疫染色的檢測(cè)試劑常常用酶標(biāo)記或者用膠體金標(biāo)記。依據(jù)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)不同，不同的標(biāo)記物各有其優(yōu)缺點(diǎn)。

組織、器官免疫染色檢測(cè)方法

方法	優(yōu) 點(diǎn)	缺點(diǎn)	推薦應(yīng)用
熒光染色	高分辨率，可以雙標(biāo)記	要求特殊顯微鏡，經(jīng)過(guò)一定時(shí)間褪色，易發(fā)生熒光猝滅	高分辨率研究，可雙標(biāo)記，酵母菌和蟲(chóng)體染色用此法
酶	高敏感性，只需普通光學(xué)顯微鏡，持久	分辨率低，受內(nèi)源性酶活性干擾，一些底物有毒性，難于雙染色	低分辨率的研究，快速檢測(cè)抗原
膠體金	高分辨率，可雙標(biāo)記，只需光學(xué)顯微鏡	尚未廣泛使用，缺乏經(jīng)驗(yàn)	組織染色較好的替代方法

四、檢測(cè)

在組織免疫染色中有兩種方法常用于標(biāo)記檢測(cè)試劑，即酶和膠體金標(biāo)記。酶標(biāo)抗體特別適用于敏感抗原的檢測(cè)，并且只要求一種相應(yīng)的底物和使用普通的光學(xué)顯微鏡檢查。重要的是還可以進(jìn)行經(jīng)典組織學(xué)中常用的復(fù)染。金標(biāo)試劑是可在光學(xué)顯微鏡水平進(jìn)行檢測(cè)的一種相對(duì)較新穎的試劑，但在過(guò)去，只廣泛應(yīng)用于電子顯微鏡。當(dāng)金標(biāo)試劑和銀增強(qiáng)劑并用，則更有獨(dú)特的優(yōu)點(diǎn)。

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