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ELISA實驗如何準確的稀釋樣本?

點擊次數(shù):28   發(fā)布時間:2024/10/23 10:06:49

 一個準確的ELISA檢測實驗,必須包含三大要素:性能可靠的試劑盒、造模成功并準確采集的樣本、可控環(huán)境且嚴謹實驗操作,三者缺一不可。在操作過程中,經(jīng)常遇到樣本稀釋問題,需要進行樣本稀釋。


一、在ELISA實驗過程中,超過試劑盒檢測范圍的,樣本值高的可能情況     

1、樣本中待測物含量過高。一些高豐度蛋白來說,比如免疫球蛋白、脂聯(lián)素、C肽、載脂蛋白等,在樣本中本身含量就很高,有的達到mg/mL濃度。

2、一些受誘導表達的細胞上清中,大量表達,比如小鼠細胞誘導后,大量表達腫瘤壞死因子α(TNFα),小鼠胰島細胞受誘導后,大量表達胰島素(INS)。

3、在一些感染性疾病中,大量表達,比如乙肝表面抗原、C反應蛋白。

4、疫苗原性研究時,注射疫苗的小鼠,會產(chǎn)生大量針對疫苗的抗體。

5、一些被濃縮的樣品,比如重組蛋白的產(chǎn)物,單克隆抗體純品等。

 

二.在ELISA檢測過程中,經(jīng)常會遇到這樣的問題:樣本測定OD值超過標曲點OD值,造成測定數(shù)據(jù)無法直接使用。樣本必須進行稀釋,如何確定測定樣本的稀釋倍數(shù)? 樣本稀釋容易犯的錯誤有哪些? 

1、稀釋不足。稀釋倍數(shù)不足時,容易導致*終結(jié)果偏小。

2、過度稀釋。過度稀釋時,容易導致*終結(jié)果偏大。

3、稀釋不夠規(guī)范,引入很多人為偏差。稀釋不夠規(guī)范,特別是大比例稀釋時,人為偏差大大增加。


三、如何確定測定樣本的稀釋倍數(shù)呢?樣本稀釋的原則如下:在查詢背景知識,或者通過預實驗,確認了樣本濃度過高,需要進行稀釋,就要根據(jù)以下原則,嚴謹操作和計算。

1、稀釋倍數(shù)合理。稀釋后樣本測定的OD值,要求落在標準品值OD值的半量程內(nèi),假定標準品值的OD值是2.4,那么稀釋后的樣本,OD值接近1.2,在這個范圍附近,計算的濃度值*為準確,以這個結(jié)果乘以稀釋倍數(shù),得到的樣本濃度*準確。

2、稀釋過程規(guī)范。特別是大倍比的稀釋,是梯度稀釋。比如樣本要稀釋200倍,就先稀釋10倍,再在10倍稀釋的基礎(chǔ)上,再進行稀釋20倍,得到200倍。

3、樣本取樣量不要太小。在樣本充足的情況下,樣本取樣量不要低于5uL,越低的取樣量,在混勻取樣過程中,誤差越大。


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